Auxin og Cytokinin:

Hvordan Hormoner kontrollerer Celledelingen i Planten.

(Oversat fra Tysk efter bedste evne. Original titel(2009): Auxin und Cytokinin: Wie Hormone die Zellteilung der Pflanzen kontrollieren.
Forfatter: Erwin Beck, Katja Hartig)

Mens reguleringen af cellecyklus hos dyr allerede er kendt i flere detaljer især fra cancerforskningen, har man stadig ikke et klart billede af regulationen hos planter, som fortsætter vækst og celledeling i hele plantens liv styret af stærke ydre faktorer. Uundværlige regulatorer for celledelingen hos planter er hormonerne Auxin og og Cytokinin, som er omtalt i det følgende.


Planterne vokser, så længe de lever og vedvarende vækst forudsætter celledeling. Dette finder sted i planter på særlige steder, de såkaldte meristems som vævdannelse (Fig. 1).
Men også celler der allerede er dannet i løbet af den individuelle udvikling og som  har opnået en vis form og funktion, kan endnu en gang være i stand til at dele sig, og således danne grundlaget for stiklingeformering. Specielt imponerende viser det sig ved, at blad stiklinger(Fig. 2). efter bladet er snittet, er i stand til at styre og omdirigere hormonstyringen ved hjælp af de stadig intakte celler. For det meste drejer det sig om celler i epidermis eller subepidermis(over og underhud), som derved genvinder evnen til celledeling, og bliver "genskabt".  Ud fra den således opståede celledannelse danner der sig ved differensiering af cellerne ny individer med identisk genetiske oplysninger , altså en klon af moderplanten. 


 To typer af plantehormon er nødvendig for celledelingen

Plantehormoner er plantens egne styringsfaktorer, som dog også kan tilføres udefra og på den måde udfolde sin virkning i planten. (Fig. 3). I det viste eksempel, det klassiske eksperiment af Skoog og Miller fra 1955 blev anvendt to forskellige hormontyper. Auxin  som er det klassiske "vækststof" og Cytokinin som har sit navn fra den stimulerende virkning på celledelingen, Cytokinese.
Begge hormoner er ikke kun nødvendig for celledeling/celleformering, men kontrollerer også det videre forløb - Differentiering - af de dannede celler.  Idag ved man at hormon tilførsel ude fra effektivt påvirker den endogene hormonmetabolisme, og sågar kan accelere den.  Derfor må man ved undersøgelse af hormonfunktionerne gå meget forsigtig til værks, for at kunne adskille primære - og sekundære effekter.

Cellekulturen som model for studiet af celledelingscyklus

I intakt cellevæv er celledeling og differentiering vanskelig at studere
adskilt, da de går hånd i hånd: For det meste drejer det sig også kun
om små grupper af celler i centrum af meristems (Fig. 4), der deler sig
samtidigt - synkront- eller sågar kun enkelte celler. Dermed står alt for
lidt synkront cellemateriale for en molekularbiologisk analyse af
cellecyklus til rådighed. Der ud over er det svært i intakt væv at
diagnosticere molekylære virkninger af hormoner.
Undersøgelsen af plantens celledeling og dens hormonelle regulering
skal dermed hyppigt foretages i en suspension cellekultur.
Ved permanent at ryste denne kultur forbliver plantecellerne i et encelle-stadium eller i en sammenhæng af kun få celler(Fig 5b). I det flydende medie står det livsnødvendige næringsstof ligeligt til rådighed for hver eneste celle. I en godt voksende cellekultur forløber celledelingen kontinuerlig, indtil der optræder en mangel i mediet (Fig. 5).

 

 

 

 




 





Derefter begynder cellerne langsomt at ældes og går efter nogen tid til grunde. I nogle tilfælde kan man ved yderligere at tilføre hormoner stimulere cellerne til videre deling. Desværre er dette et særkende for planter og kan ikke overføres til mennesker.

Forløbet af cellecyklus kan man følge når man "synkroniserer" de voksende celler i det flydende næringsmedie, dvs. alle eller næsten alle celler i en kultur og cyklus bringer i den samme fase.  Derved blokerer man den cyklus som cellerne er i på et bestemt sted ved hjælp af en inhibitor(stof som nedsætter eller bremser reaktionen) indtil alle cellerne er på dette sted og lader processen fortsætte ved at udvaske inhibitoren. Ved bestemmelse af DNA-indhold og og betragtning af Mitose måle varigheden af den enkelte fase kan man dermed bestemme den samlede cyklus.  En cellekultur der specielt godt lader sig synkronisere er Tobacco Bright Yellow-2 suspensionskultur ("Tobacco BY-2"). Disse celler har visse ligheder med rodhætte celler og anvendes i dag i mange laboratorier.
Som svarende til den af Miller og Skoog anvendte Tobakmærke (Fig. 3) behøver også Tobak-BY2 cellekulturen begge typer af plantehormoner i et ganske bestemt forhold, hvis der enten kun er tale om  celledeling ("Kallus", 2 angivet fra venstre) eller celledeling og differentiering som skal finde sted. På den måde producerer de svømmende celler i næringsopløsningen selv det nødvendige Cytokinin, mens Auxin må tilføres via mediet.






 

Plantens celledelingscyklus
på molekylærbiologisk sigt

Hver enkelt celle gennemløber under celledelingen samme rækkefølge af forskellige faser, der sammenlagt giver celledelingscyklussen (Fig. 6)(Se en cellecyklus).For at dattercellerne genetisk er helt ens med modercellerne, må forløbet af cyklus på bestemte steder testes og i givet fald repareres. Dette sker før indgangen til DNA-fordoblingen (S-fase) og før starten på den egentlige celledeling, Mitose. Ved hver Faseskift, specielt ved disse kontroller, spiller plantehormonerne en vigtig rolle.
Hver fase af cellecyklus består af et antal af enkeltreaktioner, der katalyseres af enzymer. Mange af disse enkeltskridt kræver en fosforylering af enzymer eller af strukturproteiner ved en såkalt Proteinkinase. Da der i en celle er en temmelig uoverskuelig mængde af proteinkinase, er det ikke enkelt, at finde Målproteinerne i cellecyklusens virksomme Proteinkinase. I enkelte tilfælde er de dog kendt. Således må f.eks. Histon H1 fosfyroleres, for at løse DNA ved Histonkomplex.
Før Proteinkinasen kan opfylde sin funktion, må det først aktiveres(Fig. 7). Aktiveringsfaktorerne er små proteiner, de såkaldte Cykliner, der forekommer fasespecifikt, altså cykliske. Først komplexet fra proteinkinasen og det respektive Cyklin som er enzymatisk aktiv, kan også fosforylere Målproteinerne.
På grund af afhængigheden af aktiverinsfaktoren fra Cyklin har man kaldt denne cellecyklus-drivende Proteinkinase "Cyklin-dependent kinases"(Cdk)(cyklin afhængig kinase). Fra planteceller er indtil videre tolv sådanne Cdks bekendt, men hvoraf kun tre tilskrives en virkelig betydelig rolle  i cellecyklus. Der findes dog i planter et stort antal af cykliner, 32 forskellige cykliner blev i det mindste identificeret som Gener alene i forsøgsplanten Arabidopsis thaliana.
Antallet af Cdks og Cykliner er dermed væsentligt højere end i gær eller dyr. Gær har således f.eks. kun en Cdk,  men seks  Cykliner. Mennesker besidder kun tre Cdks og fire Cykliner.

 

 Det forbløffende store antal plante Cykliner skal ses i sammenhæng med den større tilpasningsevne til vekslende miljøbetingelser for eksisterende planter i forhold til de ikke stationære dyr. Når der i planter også findes mange flere cykliner end Cdks, så må cdks udveksle deres partnercyklin ved overgang til den næste cyklusfase, som på den enkleste måde kan foregå ved proteolytisk reduktion af Cyklinerne. Nogle af disse cykliner har i deres aminosyresekvens indlagt særlige steder for angreb af protease, den såkaldte destruktionsbox. Hvis der samtidig med Cyklin nedbrydningen syntiseres et nyt cyklin, kan der dannes et nyt ckk-cyklin-komples, der kun fasespecifikt fosforylerer andre Målproteiner.
Desuden afhænger aktiviteten af Cdk ikke kun af tilstedeværelsen af et bestemt cyklin, for det egentlige aktive cdk-cyklin-kompllex kan ved hjælp af hæmmende proteiner, som for eksempel KRPs (Kip-related-proteins: Inhibitorer i den animalske cellecyklus tilsvarende planterelaterede proteiner) inaktiveres (Fig. 7).  Dermed er det dog stadig ikke nok: Bestemte Cdks må først selv på bestemte steder fosforyliseres  og andre steder defosforyliseres, hvilket muliggør en endnu finere regulation af deres aktivitet.

Den hormonelle kontrol af cellecyklus

 På hvilke steder og hvilken måde griber hormonerne Auxin og Cytokinin ind i den plantemæssige cyklus? Angående Auxin ved vi indtil nu kun, at det gennem hele celledelingscyklus skal være tilstede i en bestemt minimal koncentration, for at cyklus kan forløbe. Efter Auxin er optaget via en receptor i cellen, vil transkriptionsfaktorer for syntesen af bestemte Cdks, cykliner og andre cellecyklus-kontrolelementer blive aktiveret, andre gange vil syntesen af de proteiner, som bremser cyklus ved kontrolstederne  blive stoppet.

Auxin er altså grundliggende nødvendigt, også selvom, visse cellecyklus-kontrolelementer finder sted via den anden hormongruppe cytokinin(Fig. 8). Dette genkendes ligesom Auxin via receptorer, som derved bindes og frigøres, hvorved  komplicerede signaltransduktionskaskader udføres, og afsluttes af Transkriptionsfakorer, som tildels har den samme syntese, men også leder andre cellecykluselementer på vej. Mens den endogene auxin koncentration i løbet af celledeling mere eller mindre forbliver den samme, udsættes cytokininen i løbet af cellecyklus for periodiske udsving. Dens koncentration stiger i løbet af cyklus fase, og synker derefter ved overgangen til den næste igen (Fig. 9). Koncentrationsudsvingene styrer cellen selv, idet  den blandt andet aktiverer og deaktiverer et cytokinin hæmmende enzym i Faseforløbet. Dette enzym er Cytokininhydrogenase("CKX"), der oxidativt fjerner sidekæden fra cytokininens kernemodul og derved gør det uvirksomt (Se den kemiske formel i Fig. 3). Det resulterer nu i det øjebliklige spejl af et hormon fra sammenspillet mellem syntese og nedbrydning. Muligvis findes  i forbindelse med nedbrydningsaktivitet modstridende udsving i Biosyntese aktiviteten, men der er endnu ikke noget bekendt herom.
Hvilken betydning disse svingninger hos Cytokininkoncentration har for forløbet af Cellecyklus, lader sig ikke for tiden med sikkerhed besvare. Men der er sandsynlige tegn: Lad os huske på, at der er mange flere fase-specifikke cykliner end Cdks og at cyklinerne bytter om på deres plads på Cdks, så cyklus kan fortsættes. Det oscillerende Cytokininspejl kunne kontrollere syntese eller nedbrydning af Cyklin og dermed bidrage til udskiftning af Cyklin på Cdks. Denne sammenhæng lader sig vise gennem den tidsmæssige sammenhæng af Genexpression af  cyklinerne ved "ebbe og flod" hos Cytokininspejlet(Fig. 9).

Cytokinindehydrogase, et Nøgleenzym ved Cellecykluskontrollen

For eksperimentelt at bevise denne centrale betydning af de skiftende cytokininkoncentrationer, er det nødvendigt at gribe ind i det cellulære cytokinin forløb og derefter undersøge virkningerne på celledelingen. Cytokininspejlet kan man forhøje ved f.eks. tilsætning af Cytokinin via næringsmediet. Forbavsende nok, bevirker denne øgning af Cytokininkoncentrationen i den såkaldte Tobak BY-2 cellekultur en forsinkelse af cellecyklus. Nedsættelsen af Cytokinspejlet kan opnås med en inhibitor af Cytokininsyntesen eller ved at øge aktiviteten af cellens egen Cytokinin nedbrydning, ved at man i cellen indfører et ekstra Gen for Cytokinddehydrogenase. Ved hele tobaksplanten fører denne opnåede overekspression af Cytokininhydrogenase til en øget rodvækst på bekostning af spiring.

Overekspressionen af dette enzym i Tobakcellekultur BY-2 bevirker uventet: Varigheden af cellecyklus forkortes med 5 timer, fra 24 til 19 timer (Fig. 8), hvorved alle faser forkortes. Dette betyder, at (i det mindste ved BY-2-celler) hastigheden af Cytokinin-nedbrydningen (med)bestemmer cellecyklus hastighed. Cellen har altså behov for høje Cytokinkoncentrationer for at afslutte en cyklusfase, men lave koncentrationer for at den næste fase kan begynde. Jo hurtigere Cytokininspejlet sænkes ved slutningen af en cyklusfase, jo før begynder den næste.

Er Cytokininsignalet på et ukorrekt tidspunkt højt, f.eks. ved tilførsel af Cytokinin i vækstmediet, lige så længe kører cyklus ikke videre, før cellernes Cytokinindehydrogenase har sænket niveauet tilsvarende Cytokininspejlet. Dette er forklaringen på den forsinkende virkning af højere Cytokininkoncentrationer på fortsættelsen af cellecyklus. Men cellerne har tydeligvis brug for en forhøjet Cytokininkoncentration, for at kunne afslutte en cyklusfase. Cytokininsignaler er altså ambivalent i forhold til celledeling. Hvordan kan man forklare denne ambivalens på molekylært niveau? Man ved, at Cytokinin (som andre plantehormoner) kan inducere syntesen af Cykliner på Genekspressions niveau. På samme måde vil en sænkning af Cytokininspejlet ved  Cyklin-synteseraten under den profelytiske Cyklin-nedbrydning falde, hvorved koncentrationen af den aktuelle aktive Cyklin falder og Cdk-Cyklin-komplexet henfalder. Ved genopbygning af Cytokininkoncentrationen kan så de næste Cyklin i rækken syntetiseres, danne et ny Ckd-Cyklin-komplex, hvorved Cdk får en ny specificitet. Denne ændring kan i det mindste påvises ved en analyse af genekspression i den synkroniserede cellecyklus(Fig. 9). Imidlertid er sagen ikke helt så enkel. Som nævnt ovenfor, er der yderligere en række regulatorer og ikke mindst har det vist sig, at expressionen af bestemte Cdks også i løbet af en cyklus varierer, så cyklin-udvekslingen ved Cdk kun kan betragtes som et grundlæggende princip i cyklus-reguleringen.





 Afkortningen af Cellecyklus er ikke uden konsekvenser

Hvilken virkning har et generelt nedsat cytokininspejl , hvordan virker en forkortet med en femtedel, dvs hurtigere cellecyklus på cellerne? Konsekvenserne af den forkortede cellecyklus er dramatiske. For det første at cellerne hovedsageligt i G1 fasen ikke så meget tid til at vokse. De er kun omkring en femtedel af størrelsen af normale celler(Fig. 10). Derfor udløber delings-aktiviteten ikke som normalt efter otte dage, det står enten på så længe, indtil der ikke er mere plads i mediet til nye celler, eller mediet er helt opbrugt. Ved ophør af en cellekultur med den ekstra Cytokinindehydrogenase indeholder den fem gange så mange celler som Wildtyp-kulturen, selvom den samlede vægt af cellerne i de to er ens. Derudover danner danner celler der mangler cytokinin, lange fibre, mens den normale cellekultur har tendens til at danne småcellede klynger Fig. 10a og b). Og nok en bemærkelsesværdig forskel viser disse celler: De reagerer signifikant mere følsomt overfor AUXIN.

Kontrol af cellecyklus: en "crosstalk" mellem forskellige partnere

Effekten af et lavt Cytokininspejl på cellernes følsomhed overfor AUXIN viser en sammenhæng mellem de to hormoner, i fagjargonen benævnt som  "Cross Talk". Sådanne cross talks kan finde sted på alle niveauer i cellebiologi, eksempelvis kan begge hormoner allerede i deres biosyntese og nedbrydning gensidigt påvirke hinanden, eller kontrollere koncentrationen i hver af de andre receptorer. De kan også, som vist, sammen kontrollerer syntese og nedbrydning og dermed koncentrationen af cellecyklus elementer.
Det har også vist sig, at denne Crosstalk ikke er en toparts-samtale, men at der også er andre signaler, som registreres, som  for eksempel cellernes ernæringstilstand, der virker  sammen med de to hormoner, så det er reel diskussion der finder sted. Planter fremstår som verdensmester i crosstalk med at kombinere og tværbinde signaler. Kun på den måde kan de tilpasse sig deres miljø, da de ikke har mulighde for at kunne flytte opholdssted og på den måde tilpasse deres vækst og reproduktive live ved hjælp af dem mange eksterne og interne signaler.

Sammenfatning

Gennem et halvt århundrede har det været bekendt, at de to grupper af hormoner i planterne - Auxin og Cytokinin - kontrollerer celledelingen. Men først i nyere tid er der begyndt at tegne sig konturer af et  billede på disse kontroller indenfor det biokemiske område, hvilket de sammenfaldende men også de specielle særpræg viser i forhold til dyr og svampe. De vigtigste elementer er protein kinaser, som for at fungere behøver regulerende proteiner - de såkaldte Cykliner. Den her fremstillede biokemiske model af den molekylære kontrol af planternes cellecyklus afhænger især af medvirken af begge phytohormoner.

© 2010 akvariegødning.dk